Princípios de Espectrofotometria

por **Admin** Sáb Mar 17, 2018 3:39 pm

Princípios de Espectrofotometria

Muito do que sabemos sobre o aparelho fotossintético foi aprendido através da espectroscopia - isto é, medições da interação da luz e das moléculas. A espectrofotometria é um ramo importante da espectroscopia que se concentra na técnica de medida. Aqui vamos examinar quatro tópicos: a lei da cerveja, a medição da absorvância, dos espectros de ação e dos espectros de diferença.

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Figura 7.1.A Definição de absorvância. Um feixe luminoso incidente monocromático de intensidade I 0 atravessa uma amostra contida em uma cubeta de comprimento ( l ). Algumas das luzes são absorvidas pelos cromóforos na amostra, e a intensidade da luz que emerge é eu .

A absorvância de uma amostra pode ser relacionada à concentração das espécies absorventes através da lei de Beer :

A = ε cl
onde c é concentração, geralmente medido em moles por litro; l é o comprimento do caminho da luz, geralmente 1 cm; e ε é uma constante de proporcionalidade conhecida como coeficiente de extinção molar, com as unidades de litros por mole por centímetro. O valor de ε é uma função do composto particular a ser medido e do comprimento de onda. As clorofilas têm tipicamente um valor ε de cerca de 100 000 L mol -1 cm -1 . Quando mais de um componente de uma mistura complexa absorve a um determinado comprimento de onda, as absorventes devidas aos componentes individuais são geralmente aditivas.

O espectrofotômetro

A absorvância é medida por um instrumento chamado espectrofotômetro ( figura da Web 7.1.B ). As partes essenciais de um espectrofotômetro incluem uma fonte de luz, um dispositivo de seleção de comprimento de onda, como um monocromador ou filtro, uma câmara de amostra, um detector de luz e um dispositivo de leitura, geralmente também incluem um computador, que é usado para armazenamento e análise do espectros. As máquinas mais úteis digitalizam o comprimento de onda da luz incidente na amostra e produzem, como saída, espectros de absorvância versus comprimento de onda, como os mostrados no livro de texto Figura 7.7.

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Figura 7.1.B Diagrama esquemático de um espectrofotômetro. O instrumento consiste em uma fonte de luz, um monocromador que contém um dispositivo de seleção de comprimento de onda, como um prisma, um suporte de amostra, um fotodetetor e um gravador ou computador. O comprimento de onda de saída do monocromador pode ser alterado pela rotação do prisma; O gráfico da absorvância versus o comprimento de onda é chamado de espectro.

Spectra de ação

O uso de espectros de ação tem sido fundamental para o desenvolvimento de nossa compreensão atual da fotossíntese. Um espectro de ação é um gráfico da magnitude do efeito biológico observado como função do comprimento de onda. Exemplos de efeitos medidos por espectros de ação são a evolução do oxigênio ( Figura 7.1.C ) e as respostas do crescimento hormonal devido à ação do fitocromo (ver Capítulo 16 do livro didático). Muitas vezes, um espectro de ação pode identificar o cromóforo responsável por um fenômeno particular induzido por luz. Os espectros de acção foram instrumentais na descoberta da existência dos dois fotossistemas em O 2 -evolving organismos fotossintéticos.

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Web Figura 7.1.C Um espectro de ação em comparação com um espectro de absorção. O espectro de absorção é medido como mostrado na figura 7.1.B. Um espectro de ação é medido ao traçar uma resposta à luz, como a evolução do oxigênio, em função do comprimento de onda. Se os pigmentos usados para obter o espectro de absorção são os mesmos que causam a resposta, os espectros de absorção e ação coincidirão. No exemplo mostrado aqui, o espectro de ação para a evolução do oxigênio corresponde bastante ao espectro de absorção de cloroplastos intactos, indicando que a absorção de luz pelas clorofilas medeia a evolução do oxigênio. As discrepâncias são encontradas na região de absorção de carotenóides, de 450 a 550 nm, indicando que a transferência de energia de carotenóides para clorofilas não é tão eficaz quanto a transferência de energia entre clorofilas.

Alguns dos primeiros espectros de ação foram medidos por TW Engelmann no final dos anos 1800 ( Web Figure 7.1.D ). Engelmann usou um prisma para dispersar a luz solar em um arco-íris que foi permitido cair em um filamento de algas aquáticas. Uma população de O 2 bactérias -seeking foi introduzido no sistema. As bactérias se congregaram nas regiões dos filamentos que evoluíram mais O 2. Estas foram as regiões iluminadas por luz azul e luz vermelha, que são fortemente absorvidas pela clorofila. Hoje, os espectros de ação podem ser medidos em espectrógrafos de tamanho de sala em que o cientista entra em um monocromador enorme e coloca amostras para irradiação em uma grande área da sala banhada por luz monocromática. Mas o princípio da experiência é o mesmo que os experimentos de Engelmann.

Figura 7.1.D Diagrama esquemático das medidas do espectro de ação por TW Engelmann. Engelmann projetou um espectro de luz no cloroplasto espiral da alga filamentosa Spirogyra e observou que bactérias que buscam oxigênio foram introduzidas no sistema coletado na região do espectro onde os pigmentos de clorofila absorvem. Este espectro de ação deu a primeira indicação da eficácia da luz absorvida por pigmentos acessórios na condução da fotossíntese.

Diferença Spectra

Uma técnica importante em estudos de fotossíntese é a espectroscopia de diferença induzida pela luz, que mede as mudanças na absorvência ( Figura 7.1.E). Nesta técnica, a luz brilhante, frequentemente chamada de luz actínica, é usada para iluminar uma amostra, enquanto um feixe de luz fraco é usado para medir a absorvância da amostra em comprimentos de onda diferentes da viga actínica. Desta forma, obtém-se um espectro de diferença, que representa as mudanças no espectro de absorção da amostra induzida pela iluminação com a luz actínica. As bandas de absorção que desaparecem após a iluminação aparecem como picos negativos; As novas bandas que aparecem na iluminação aparecem como picos positivos. Os espectros de diferença fornecem pistas importantes para a identidade de espécies moleculares que participam nas fotorreacções da fotossíntese. O diferencial de espectro da fotooxidação de P700 (uma clorofila que absorve a luz do comprimento de onda 700 nm, ver o livro de texto Figura 7.19) é mostrado na Figura 7.1.F da Web (Ke 1973).

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Web Figura 7.1.E Princípio da espectroscopia de diferença. Medimos os espectros de diferença observando, em função do tempo, a alteração na absorvância de uma luz de medição λ 1 em uma amostra quando uma luz actínica é ligada. A luz actínica λ 2 provoca alterações químicas na amostra que alteram seu espectro de absorção. Os filtros de bloqueio são necessários para evitar que a luz actínica dispersa entre no detector. As setas para cima e para baixo significam os tempos em que a luz actínica foi ligada e desligada, respectivamente. A alteração na absorvência induzida pela luz actínica, Δ A, pode ser positivo ou negativo. Geralmente, as medições são feitas em um comprimento de onda por vez. Um espectro de diferença é construído pela repetição da medida em muitos comprimentos de onda diferentes.

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Figura 7.1.F Espectáculo de diferença de luz-menos-escuro para fotooxidação de P700, medido como mostrado na Figura 7.1.E da Web . As diminuições de absorção (branqueamento) a 430 e 700 nm são devidas à perda da absorvência de P700. Os aumentos observados em torno de 450 nm e superiores a 730 nm são devidos à absorção por P700 + (P700 oxidado). (Depois de Ke, 1973.)

Com o uso de técnicas de flash especiais, é possível registrar o espectro de diferenças em um determinado momento após a excitação do flash. Espectos de diferença múltipla gravados em diferentes momentos após a excitação instantânea podem ser usados para medir a cinética das reações químicas que seguem a excitação de fótons de um centro de reação. Essas técnicas podem ter uma resolução de tempo extraordinária, em alguns casos, menos do que um picosecond (10 a 12 s), e forneceram grandes conhecimentos sobre os primeiros eventos no processo de armazenamento de energia fotossintetizada.

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